Modulation von Myosin durch kardiales Myosin-Bindungsprotein - Shenyang VisionaryPeak Ventures Co.,Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 4337 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das kardiale Myosin-bindende Protein C (cMyBP-C) ist ein wichtiger Regulator der Sarkomerfunktion. Eine verringerte Phosphorylierung von cMyBP-C wurde mit einer beeinträchtigten Kontraktilität bei Patienten mit Herzinsuffizienz in Verbindung gebracht. Hier verwendeten wir die zuvor veröffentlichten cMyBP-C-Peptide 302A und 302S, Ersatzstoffe für die regulatorische Phosphorylierungsstelle Serin 302, als Hilfsmittel zur Bestimmung der Auswirkungen der Modulation des Dephosphorylierungszustands von cMyBP-C auf die Herzkontraktion und -entspannung bei experimenteller Herzinsuffizienz (HF). ) Modelle in vitro. Beide Peptide erhöhten die Kontraktilität von Papillarmuskelfasern, die aus einem Mausmodell isoliert wurden, das konstitutiv cMyBP-C-Phosphoablation (cMyBP-CAAA) exprimierte. Insbesondere das Peptid 302A könnte auch die Kraftneuentwicklungsrate (ktr) in Papillarmuskelfasern von cMyBP-CAAA-Mäusen (nicht phosphorylierte Alanine) verbessern. In Übereinstimmung mit den obigen Erkenntnissen erhöhten beide Peptide die ATPase-Raten in Myofibrillen, die aus Ratten mit Myokardinfarkt (MI) isoliert wurden, nicht jedoch aus Scheinratten. Darüber hinaus verbesserten beide Peptide im cMyBP-CAAA-Mausmodell die ATPase-Hydrolyseraten. Diese Veränderungen wurden bei nicht-transgenen (NTG) Mäusen oder Scheinratten nicht beobachtet, was auf die spezifische Wirkung dieser Peptide bei der Regulierung des Dephosphorylierungszustands von cMyBP-C unter den pathologischen Bedingungen von HF hinweist. Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass die Modulation des cMyBP-C-Dephosphorylierungszustands ein therapeutischer Ansatz zur Verbesserung der Myosinfunktion, der Kontraktilität des Sarkomers und der Entspannung nach einem unerwünschten kardialen Ereignis sein kann. Daher könnte die gezielte Behandlung von cMyBP-C möglicherweise die allgemeine Herzleistung als Ergänzung zu Standardmedikamenten bei Herzinsuffizienzpatienten verbessern.

Das kardiale Myosin-bindende Protein-C (cMyBP-C) ist ein 140 kDa dickes Sarkomer-Filamentprotein, das sich in regelmäßigen Abständen in der C-Zone des Sarkomers lokalisiert, um die Struktur und Funktion des Sarkomers im Herzen zu regulieren1,2. Die Regulierung von cMyBP-C erfolgt durch drei Phosphorylierungsstellen an der M-Domäne und die Wechselwirkung seiner N-terminalen Region mit Myosin und Actin3,4. Während cMyBP-C unter normalen physiologischen Bedingungen stark phosphoryliert ist, sinkt sein Phosphorylierungsgrad im Krankheitszustand5. Dies kann sowohl in präklinischen Herzinsuffizienzmodellen (HF) als auch klinisch bei Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie (HCM), HF oder Vorhofflimmern beobachtet werden6. Trotz der klaren Vorteile der gezielten Behandlung von cMyBP-C ist derzeit kein Medikament verfügbar, um dephosphoryliertes cMyBP-C direkt zu modifizieren und so die Herzfunktion zu verbessern.

cMyBP-C-Proteine von Mensch und Maus haben drei Hauptphosphorylierungsstellen, insgesamt mehr als 17 Stellen7,8. Diese befinden sich in der M-Domäne am N-Terminus des Moleküls und fehlen alle in der Skelettmuskel-Isoform9. Die Region des N-Terminus bindet an das S2-Segment von Myosin, nahe der Hebelarmdomäne10,11. Diese Interaktion kann durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung von cMyBP-C dynamisch reguliert werden. Unter physiologischen Bedingungen erleichtert phosphoryliertes cMyBP-C die Aktivierung des Cross-Bridge-Zyklus und bindet die dicken und dünnen sarkomeren Filamente12. Wenn cMyBP-C jedoch bei Erkrankungen dephosphoryliert, interagiert es stark mit Myosin und verhindert so dessen krafterzeugende Wechselwirkung mit Aktin13,14,15. In ähnlicher Weise verringert die katalytische Spaltung der N-terminalen Region von cMyBP-C während eines Myokardinfarkts die Anzahl der Phosphorylierungsstellen, was zu einer verminderten Kontraktilität und Funktion des Herzens führt16.

Frühere Studien haben die Notwendigkeit und Hinlänglichkeit der cMyBP-C-Phosphorylierung zur Regulierung der normalen Herzfunktion festgestellt17,18,19,20. Diese Studien verwendeten herzspezifische transgene (TG) Mäuse, die phosphoablatiertes cMyBP-C an Ser-273-Ala/Ser-282-Ala/Ser-302-Ala-Stellen (AAA) oder phosphomimetisches cMyBP-C an Ser-273-Ala/Ser-282-Ala/Ser-302-Ala-Stellen exprimierten. 273-Asp/Ser-282-Asp/Ser-302-Asp (DDD) im Vergleich zu nicht-transgenen (NTG) Kontrollmäusen. Um cMyBP-C therapeutisch zur Verbesserung der Herzfunktion nach einem unerwünschten Herzereignis einzusetzen, verwendeten wir daher präklinische Modelle, wie in der Literatur berichtet. Im ersten Modell wurden alle drei Serinphosphorylierungsstellen (273, 282 und 302) zu nicht phosphorylierbaren Alaninen (AAA) mutiert18. In einem anderen Modell wurden sie zu phosphomimetischen Asparaginsäuren (DDD)19 mutiert, um den physiologischen Zustand des Herzens nachzuahmen. Der AAA-Ersatz führte zu einer verminderten Herzfunktion, so dass das Protein den cMyBP-C-Null-Phänotyp nicht retten konnte18, während die DDD-Substitution den cMyBP-C-Null-Phänotyp retten konnte19. Der von der transgenen Maus exprimierte cMyBP-C-Wildtyp diente als NTG-Kontrolle.

Hier haben wir die Peptide getestet, die auf der M-Domäne von cMyBP-C21 basieren. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Peptide wahrscheinlich die Interaktion von cMyBP-C und Myosin unterbrechen und so die Interaktion des Myosinkopfes mit dem dünnen Filament und damit den Krafthub verbessern würden. Die getesteten cMyBP-C-Peptide könnten die enge Interaktion zwischen cMyBP-C und Myosin unterbrechen und die dicken Filamente freisetzen, um ihre Interaktion mit den dünnen Filamenten wieder aufzunehmen und so die Muskelkontraktilität zu verbessern. Tatsächlich verhinderte das permeabilisierende Peptid 302A, das den Phosphorylierungsstandort 302 ersetzt, die Interaktion von Myosin mit cMyBP-C, was zu dessen Bewegung in Richtung Aktin führte, was wiederum zur Bildung von Aktomyosin-Wechselwirkungen und Querbrücken führte und so die Kontraktilität steigerte. Insgesamt führte die Untersuchung des Peptids 302A in vitro zur Entdeckung einer verbesserten Krafterzeugung und Kalziumempfindlichkeit in Herzmuskelfasern. Allerdings sind die Mechanismen, die der Verbesserung der kontraktilen Kinetik im Verhältnis zum Phosphorylierungsstatus von cMyBP-C zugrunde liegen, noch nicht vollständig aufgeklärt. Unter pathologischen Bedingungen haben wir, wie oben vorgeschlagen, die Hypothese aufgestellt, dass Peptid 302A die Bindungseigenschaften von cMyBP-C in seinem dephosphorylierten Zustand verändert, um die Herzkinetik zu verbessern. Um diese Hypothese zu testen, wurden die Wirkungen der cMyBP-C-Peptide 302A und 302S in drei verschiedenen In-vitro-Assays bewertet: einem Steady-State-ATPase-Assay, einem Myofibrillen-ATPase-Assay und einem Papillarmuskel-Assay. Daten aus In-vitro-Assays und präklinischen HF-Modellen liefern starke Beweise dafür, dass die Modulation von cMyBP-C und damit seines Phosphorylierungsstatus die ATPase-Aktivität und Kraftkinetik in einer Weise erhöht, die die gesamte Herzleistung verbessert.

Um die Auswirkung des cMyBP-C-Phosphorylierungsstatus auf das MI-HF-Rattenmodell zu testen, haben wir zu fünf verschiedenen Zeitpunkten nach der MI-Operation Proteinproben aus der linksventrikulären (LV) Infarktzone von MI-Ratten und einem vergleichbaren Bereich von Scheintieren gesammelt : Tag 1, Tag 3, Woche 1, Woche 4 und Woche 8. Die globalen Herzfunktionsparameter wurden zu vier Zeitpunkten (Tag 3, Woche 1, Woche 4 und Woche 8) nach der MI-Operation gemessen, um die Entwicklung einer Herzinsuffizienz zu bestätigen (Ergänzende Abbildung S1). Die cMyBP-C-Phosphorylierung wurde mithilfe von Antikörpern nachgewiesen, die speziell auf Serinphosphorylierungsstellen an den Positionen 273, 282 und 302 abzielen, sowie mithilfe von Antikörpern zum Nachweis der gesamten cMyBP-C-Expressionsniveaus (Abb. 1, ergänzende Abbildungen S2–7). Alpha-Actin wurde als Housekeeping-Protein zur Normalisierung an Tag 1 und Tag 3 verwendet. HPRT wurde aufgrund der signifikanten Reduzierung von Alpha-Actin als Housekeeping-Protein zur Normalisierung in Woche 1, Woche 4 und Woche 8 nach dem Myokardinfarkt verwendet Werte in Woche 1 nach MI (Ergänzende Abbildung S8). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expressionsniveaus von Gesamt-cMyBP-C zusammen mit den drei phosphorylierten Serinresten (p273, p282 und p302) zu frühen Zeitpunkten (Tag 1 und Tag 3) signifikant reduziert waren, gefolgt von einem Rückgangstrend bei Woche 1 Post-MI-Proben (Abb. 1, ergänzende Abbildungen S2–S5). Überraschenderweise nahm die Expression aller drei Phosphorylierungsstellen zu späteren Zeitpunkten zu (Proben in Woche 4 und Woche 8 nach MI; ergänzende Abbildung S2), mit Ausnahme von p273 in Woche 8, möglicherweise das Ergebnis eines kompensatorischen Effekts mit fortschreitender Herzinsuffizienz. Wir stellten fest, dass die Expression des gesamten cMyBP-C eng dem Trend der Änderungen der cMyBP-C-Phosphorylierung folgte (Abb. 1, ergänzende Abb. S2), was darauf hindeutet, dass der Haupteffekt der Herzverletzung auf der gesamten cMyBP-C-Expression lag. Daher haben wir das Verhältnis der cMyBP-C-Phosphosite (p273, p282 und p302) zur gesamten cMyBP-C-Expression berechnet (ergänzende Abbildung S8). Die Phosphorylierung der cMyBP-C-Stellen (p273 und p282) zu Gesamt-cMyBP-C blieb am Tag 1 nach dem Myokardinfarkt unverändert, stieg jedoch an allen drei Phosphostellen (p273, p282 und p302) an Tag 3, Woche 1 und Woche 4 signifikant an und Woche 8 nach dem Myokardinfarkt im Vergleich zur Scheinuntersuchung. Darüber hinaus haben wir auch die Expression von Troponin T und Troponin I getestet, die ebenfalls zu allen Zeitpunkten eine konsistente Verringerung zeigte (ergänzende Abbildung S9). Interessanterweise war die verminderte Expression der schweren Kette von Myosin (MHC) verzögert und wurde erst am Tag 3 nach dem Myokardinfarkt beobachtet. Es kam zu einer schnellen Kompensation der MHC-Expression mit einem dramatischen Anstieg zu späteren Zeitpunkten (Woche 4 und Woche 8 nach MI; ergänzende Abbildung S9).

Die cMyBP-C-Phosphorylierung war am Tag 1 und am Tag 3 reduziert, jedoch nicht in Woche 1 bei Ratten nach MI im Vergleich zur Scheinuntersuchung. (A) Western Blot (Wes) von phosphoryliertem cMyBP-C, getestet mit ortsspezifischen Phospho-cMyBP-C-Antikörpern p273, p282, p302, Gesamt-cMyBP-C-Antikörpern und Housekeeping-Protein-Antikörpern Alpha-Actin oder HPRT. Ganze Homogenate aus linksventrikulärem Infarktgewebe von MI-Ratten und der gleiche Bereich von Scheinratten wurden für Wes verwendet. Jede Spur stellt eine einzelne Kapillare dar, die mit der gleichen Menge an Proteinen beladen ist. Originalbilder von Wes in voller Länge sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. S3–S5. (B) Quantifizierung von cMyBP-C p273, p282 und p302, normalisiert auf Housekeeping-Proteine. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar (N = 6–8). **p < 0,01; ***p < 0,005; ****p < 0,001; ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test.

Um den Phosphorylierungsstatus von cMyBP-C bei menschlicher Herzinsuffizienz zu testen, wurde eine Immunhistochemie (IHC) mit Herzgewebeschnitten von normalen gesunden Spendern sowie von Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie (HCM) und dilatativer Kardiomyopathie (DCM) (N = 4 Patienten pro Gruppe) durchgeführt , Abb. 2A). HCM- und DCM-Proben wurden von einem ausgebildeten Physiologen bestätigt. Die IHC wurde unter Verwendung von Antikörpern gegen p273 und p282 sowie eines Antikörpers gegen Gesamt-cMyBP-C durchgeführt. Die relative Expression von p273 war in Herzgeweben von HCM-Patienten leicht verringert, nicht jedoch von DCM-Patienten (normal 0,72 ± 0,08 vs. HCM 0,48 ± 0,06, p = 0,06; DCM 0,78 ± 0,10; n = 16; Abb. 2B). Andererseits war die relative Expression von p282 sowohl bei HCM- als auch bei DCM-Patienten signifikant reduziert (Normal 1,64 ± 0,16 vs. HCM 0,93 ± 0,06, p < 0,005; Normal 1,64 ± 0,16 vs. DCM 1,04 ± 0,11, p < 0,01). Daher sprachen IHC-Daten von menschlichen Patienten stark für eine verringerte cMyBP-C-Phosphorylierung bei menschlicher Herzinsuffizienz.

Die Immunhistochemie von Herzgewebeschnitten von HCM- und DCM-Patienten zeigte eine verringerte cMyBP-C-Phosphorylierung im Vergleich zu gesunden Spendern. (A) IHC-Bilder von p273 und p282 in normalen, HCM- und DCM-Herzproben. (B) Entsprechende Quantifizierung von p273 und p282 in allen Herzproben. Die p273- und p282-Werte wurden auf die gesamten cMyBP-C-Werte normalisiert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (N = 4 Patienten, n = 16 Bilder). Der Maßstabsbalken in Zahlen entspricht 20 µm. DCM, dilatative Kardiomyopathie; HCM, hypertrophe Kardiomyopathie: IHC, Immunhistochemie. **p < 0,01; ***p < 0,005; einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Posttest.

Die Wirkung der cMyBP-C-Peptide 302A und 302S (Tabelle 1) auf die Modulation von cMyBP-C wurde in drei verschiedenen In-vitro-Tests getestet. Der Steady-State-ATPase-Assay umfasste Myosin, Aktin und cMyBP-C voller Länge (FL) oder verkürzte rekombinante C0-C2-Proteine (entweder nicht phosphoryliert [−P] oder phosphoryliert [+P]). Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des bei der ATP-Hydrolyse freigesetzten Pi gemessen. Eine Hemmung der Myosin-ATPase-Aktivität wurde mit zunehmenden Konzentrationen sowohl der C0-C2- als auch der FL-cMyBP-C-Proteine beobachtet (Abb. 3A, C). C0-C2 hemmte die ATPase-Aktivität viel stärker als das FL-cMyBP-C-Protein (3,16 ± 0,18 vs. 6,66 ± 0,11 µM). Obwohl das phosphorylierte Protein, entweder C0-C2 oder FL, die Hemmkurve nach rechts verschob, steigerte weder das 302A- noch das 302S-Peptid die Myosin-ATPase-Aktivität, getestet bei verschiedenen Konzentrationen (Abb. 3B, D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die rekombinanten Sarkomerproteine Myosin und Actin allein in Gegenwart der Peptide möglicherweise nicht ausreichen, um die ATPase-Aktivität zu beeinflussen und die Sarkomerfunktion zu ermöglichen. Stattdessen könnten cMyBP-C-Peptide nur in Gegenwart einer weiter entwickelten, intakten Sarkomerarchitektur funktionsfähig werden und die ATPase-Aktivität in vitro steigern.

cMyBP-C-Peptide haben keinen Einfluss auf den Steady-State-ATPase-Assay mit verkürztem cMyBP-C C0C2 oder FL cMyBP-C. (A) Dephosphoryliertes FL-cMyBP-C hemmte die Myosin-ATPase-Aktivität stärker als die Hemmung von Myosin durch phosphoryliertes cMyBP-C. (B) cMyBP-C 302A- oder 302S-Peptide hatten keinen Einfluss auf die Myosin-ATPase FL-cMyBP-C-Aktivität. (C) Dephosphoryliertes cMyBP-C C0-C2 hemmte die Myosin-ATPase-Aktivität, nicht jedoch phosphoryliertes cMyBP-C. (D) Die cMyBP-C-Peptide 302A oder 302S hatten keinen Einfluss auf die CO-C2-Myosin-ATPase-Aktivität. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (N = 4–12). FL, abendfüllend. Scr, durcheinander.

Um die Rolle von cMyBP-C auf die ATPase-Aktivität bei einem intakten Sarkomer weiter zu untersuchen, isolierten wir Myofibrillen aus Herzproben von Scheinratten und Post-MI-Ratten der ersten Woche, in denen Sarkomerproteine im nativen Zustand vorhanden sind. Mittels Gelelektrophorese wurde die Integrität des vollständig intakten Sarkomers bestätigt, indem das Vorhandensein aller wichtigen myofibrillären Proteine, einschließlich MHC, cMyBP-C, Actinin, Troponin T, α-Tropomyosin, sowie der Proteine der Myosin-Leichtkette (MLC) überprüft wurde ( Ergänzende Abbildung S10A). Wir beobachteten eine konsistente Verringerung der Phosphorylierung von cMyBP-C p273, p282 und p302 in den Myofibrillen ab Woche 1 nach MI im Vergleich zu Myofibrillen, die aus Scheintieren isoliert wurden (Ergänzende Abbildungen S10B – D, S11), ohne dass sich der andere Hauptbestandteil änderte Sarkomerproteine (Ergänzende Abb. S10E, F). Anschließend bewerteten wir die Wirkung der cMyBP-C-Peptide im myofibrillären ATPase-Assay, bei dem Peptide mit intakten Sarkomerproteinen interagieren können (Abb. 4). Bei myofibrillären Proteinen, die aus der MI-Infarktregion isoliert wurden, wurde im Vergleich zu myofibrillären Proteinen, die aus Schein- oder MI-Remote-Regionen isoliert wurden, eine signifikante Verringerung der Myosin-ATPase-Aktivität beobachtet (Schein 159,8 ± 12,59 vs. MI-Remote 144,1 ± 9,81 vs. MI-Infarkt 67,8 ± 12,18). , p < 0,005, Abb. 4A). Unterdessen zeigte keines der Peptide (durcheinandergemischt, 302A oder 302S) irgendeine Wirkung auf myofibrilläre Proteine aus den Scheinherzen (Abb. 4B). Umgekehrt verbesserten die cMyBP-C-Peptide 302A und 302S die maximale ATPase-Aktivität in Myofibrillen von infarktierten Herzen in Woche 1 nach MI von 60,9 ± 5,3 nmol Pi/min/mg (Schein, n = 15) auf 87,9 ± 7,1 nmol Pi/ min/mg (302A, n = 12; p < 0,05) bzw. 91,3 ± 6,2 nmol Pi/min/mg (302S, n = 12; p < 0,05) (Abb. 4C).

Die Myofibrillen-ATPase-Aktivität wurde durch die cMyBP-C-Peptide 302A und 302S in Woche 1 bei Post-MI-Ratten erhöht, jedoch nicht bei Scheinratten. (A) Die ATPase-Aktivität war in Myofibrillen aus der MI-Infarktzone um mehr als 50 % reduziert, blieb jedoch in Myofibrillen aus der MI-Remotezone im Vergleich zu Myofibrillen aus Scheinherzen unverändert (links). Die Myofibrillen-ATPase-Aktivität wurde durch das im Test verwendete Myofibrillenprotein normalisiert. Die maximale ATPase-Aktivität bei pCa 2,0 wurde im Balkendiagramm (Mitte) aufgetragen. Der pCa50 wurde auch aufgezeichnet, um die Kalziumempfindlichkeit zu testen (rechts). (B) Die cMyBP-C-Peptide 302A und 302S veränderten die maximale ATPase-Aktivität in aus Scheinratten isolierten Myofibrillen nicht (links und Mitte). Bei Scheinproben (rechts) wurde in keiner der Behandlungsgruppen eine Veränderung der Kalziumempfindlichkeit festgestellt. (C) Die cMyBP-C-Peptide 302A und 302S erhöhten die maximale ATPase-Aktivität in Myofibrillen, die aus der Infarktzone von Ratten in Woche 1 nach MI isoliert wurden, im Vergleich zu nicht behandelten Kontroll- und Rührpeptid-behandelten Myofibrillen (links und Mitte). In keiner der Behandlungsgruppen in MI-Proben wurde eine Veränderung der Kalziumempfindlichkeit festgestellt (rechts). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (N = 8–15); *p < 0,05; ***p < 0,005; einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Posttest. MI, Myokardinfarkt.

Als nächstes untersuchten wir die ATPase-Aktivität und die Rolle von cMyBP-C in Myofibrillen, die aus transgenen cMyBP-C AAA- und DDD-Mausmodellen isoliert wurden (Abb. 5). Die Myosin-ATPase-Aktivität war in Myofibrillen von DDD-Mäusen (131,2 ± 9,33 nmol Pi/min/mg) im Vergleich zu Myofibrillen von NTG (93,98 ± 7,85 nmol Pi/min/mg, p < 0,01) und AAA (71,06 ± 6,25 nmol Pi) signifikant hochreguliert /min/mg) Mäuse (Abb. 5A). In Übereinstimmung mit Scheindaten verbesserte keines der Peptide (durcheinander, 302A und 302S) die ATPase-Aktivität in Myofibrillen von NTG-Mäusen (Abb. 5B). Andererseits zeigten sowohl 302A- als auch 302S-Peptide eine erhöhte maximale ATPase-Aktivität von 62,74 ± 4,27 nmol Pi/min/mg (Kontrolle, n = 11) und 58,58 ± 6,67 nmol Pi/min/mg (durcheinander, n = 10) auf 94,29 ± 11,01 nmol Pi/min/mg (302A, n = 10) und 95,05 ± 10,02 nmol Pi/min/mg (302S, n = 10), was einem Anstieg von 61 % (302A) bzw. 62 % (302S) gegenüber dem Durcheinander entspricht , bzw. (Abb. 5C). Weder das cMyBP-C 302A- noch das 302S-Peptid beeinflussten die Kalziumempfindlichkeit in präklinischen MI- oder AAA-HF-Modellen.

Wirkung der cMyBP-C-Peptide 302A und 302S in NTG- und TG-Mäusen. (A) Die ATPase-Aktivität ist bei DDD-TG-Mäusen höher als bei NTG-Mäusen. Die ATPase-Aktivität nahm bei AAA-TG-Mäusen ab (links). Die maximale ATPase-Aktivität bei pCa 2,0 wurde im Balkendiagramm (Mitte) aufgetragen. Der pCa50 wurde auch aufgezeichnet, um die Kalziumempfindlichkeit zu testen (rechts). (B) Weder cMyBP-C-Peptid 302A noch 302S veränderten die maximale ATPase-Aktivität in Myofibrillen, die aus Scheinmäusen isoliert wurden (links und Mitte). Bei Scheinproben (rechts) wurde in keiner der Behandlungsgruppen eine Veränderung der Kalziumempfindlichkeit festgestellt. (C) Die cMyBP-C-Peptide 302A und 302S erhöhten die maximale ATPase-Aktivität in Myofibrillen, die aus den transgenen Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu Myofibrillen ohne Behandlung oder mit durcheinandergemischten Peptiden behandelten Myofibrillen (links und Mitte). In keiner der Behandlungsgruppen in TG-Proben wurde eine Veränderung der Kalziumempfindlichkeit festgestellt (rechts). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (N = 8–15); *p < 0,05; ***p < 0,005; einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Posttest. TG, transgene Mäuse.

Wir haben die Erkenntnisse aus Myofibrillen erweitert, um sie im Papillarmuskel zu untersuchen, der dem In-vivo-Zustand näher kommt, um festzustellen, ob synthetische cMyBP-C-Peptide die Sarkomerfunktion beeinflussen könnten. Um dies zu erreichen, wurde die pCa-Kraft-Beziehung in den Papillarmuskeln von AAA- und DDD-Mausherzen im Alter von 3 Monaten im Vergleich zu altersentsprechenden NTG-Kontrollen gemessen (Abb. 6). Im Vergleich zu NTG- und DDD-Fasern stellten wir fest, dass AAA-Fasern ein signifikantes Defizit bei der Entwicklung maximaler Kraft bei pCa 4,5 sowie eine signifikante Abnahme der Kalziumempfindlichkeit aufwiesen, was auf mechanische Defizite auf Myofilamentebene hindeutet (Abb. 6A–E). In Übereinstimmung mit Myofibrillen-ATPase-Aktivitätsmessungen verbesserte die Inkubation mit entweder 25 µM oder 50 µM 302S-Peptid die Kraftproduktion in AAA-Papillarfasern signifikant, während 302A-Peptid die Kraft ebenfalls erhöhte, jedoch nicht signifikant (p = 0,0514) (Abb. 6D, ergänzende Abb. S12A). ). Sowohl 302S- als auch 302A-Peptide zeigten eine signifikante Wirksamkeit bei der Verbesserung der Kalziumempfindlichkeit in AAA-Fasern (Abb. 6E, ergänzende Abb. S12B). Wir haben auch ein phosphomimetisches cMyBP-C-Peptid 302D getestet, das weder in NTG-, AAA- noch in DDD-Papillarfasern zu einer Verbesserung der Kraftproduktion führte (ergänzende Abbildung S13). Um die Auswirkungen der 302A- und 302S-Peptide auf die Herzfunktion weiter zu charakterisieren, führten wir eine Messung der Kraftneuentwicklungsrate (ktr) als indirektes Maß für die Entspannung durch. Das Peptid 302A, nicht jedoch das Peptid 302S, verbesserte die ktr-Aktivität, was darauf hindeutet, dass letzteres nur die Kontraktilität und nicht die Entspannung beeinflusst (Abb. 6F). Die verbesserten Auswirkungen auf ktr wurden auch mit 302A-Peptid bei 25 µM beobachtet (ergänzende Abbildung S12C).

Die Herzfunktion wurde durch die cMyBP-C-Peptide 302A und 302S in Muskelfasern verbessert, die aus transgenen AAA-Mäusen isoliert wurden, jedoch nicht bei NTG- oder DDD-TG-Mäusen. Kraft-pCa-Kurven (A–C), die bei einer Sarkomerlänge von 2,0 μM in Gegenwart verschiedener Peptide (50 μM) erzeugt wurden. Maximale Kraftproduktion (D, mN/mm2), Kalziumempfindlichkeit (E, pCa50) und Geschwindigkeit der Kraftregeneration (F, ktr) wurden in Gegenwart verschiedener Peptide (50 μM) in NTG (weißer Balken), AAA ( roter Balken) und DDD (grüner Balken). N = 4 Papillarfasern pro Peptidbehandlung von 4 Tieren pro Gruppe. *p < 0,05 einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Posttest. AAA, nichtphosphorylierte Alanine; DDD, phosphomimetische Asparaginsäuren; NTG, nicht transgene Mäuse. Scr, durcheinander.

cMyBP-C ist ein wichtiger Regulator der Herzkontraktilität mit mehr als 300 Mutationen im MYBPC3-Gen, die direkt mit der Entwicklung von Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz verbunden sind22,23. Obwohl in präklinischen und klinischen Modellen gezeigt wurde, dass die Phosphorylierung von cMyBP-C unter pathologischen Bedingungen signifikant abnimmt, wurde über die dynamische Veränderung der cMyBP-C-Expression und ihre Bedeutung für die Herzkinetik zu verschiedenen Zeitpunkten nicht berichtet. In dieser Studie haben wir die Dynamik der cMyBP-C-Dephosphorylierung während der Entwicklung von HF in einem Ratten-MI-Modell charakterisiert. Die cMyBP-C-Phosphorylierung nahm innerhalb einer Woche (am Tag 1 und Tag 3 nach dem MI, Abb. 1) nach der Herzverletzung signifikant ab, stieg jedoch zu späteren Zeitpunkten signifikant an (Woche 4 und Woche 8 nach dem MI, ergänzende Abb. S2). , was auf eine kompensatorische Wirkung im Herzen schließen lässt. Auch das Gesamt-cMyBP-C nahm zu verschiedenen Zeitpunkten im präklinischen HF-Modell des MI ab. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der cMyBP-C-Phosphorylierungszustand zeitlich begrenzt ist und in Kombination mit einer verminderten cMyBP-C-Gesamtexpression zur Entwicklung von Herzinsuffizienz beiträgt. Daher haben wir auf der Grundlage unserer Erkenntnisse aus präklinischen Tiermodellen die Hypothese aufgestellt, dass Interventionsstrategien, die auf cMyBP-C in seinem pathogenen dephosphorylierten Zustand zu relevanten Zeitpunkten abzielen, nützlich sind. Der akute Verlust des gesamten cMyBP-C im Blutkreislauf steht im Einklang mit früheren Studien, was darauf hindeutet, dass cMyBP-C als potenzieller diagnostischer Biomarker für MI und prognostischer Marker für HF24 dienen könnte. Bei menschlichen HCM- und DCM-Patienten ist die cMyBP-C-Phosphorylierung mit der Entwicklung einer Krankheitsprogression verbunden25,26. Bei HCM-Patienten waren sowohl p273 als auch p282 reduziert (Abb. 2). Über die Hierarchie der cMyBP-C-Phosphorylierungsstellen wurde berichtet20. Ser-282 spielt eine einzigartige regulatorische Rolle, da seine Phosphorylierung für die anschließende Phosphorylierung von Ser-302 entscheidend ist. Aufgrund seiner Bedeutung für die cMyBP-C-Funktion beobachteten wir eine Abnahme der ser-282-Phosphorylierung sowohl bei DCM- als auch bei HCM-Patienten (Abb. 2). Ser-273 wird sowohl durch Proteinkinase A (PKA) als auch durch Proteinkinase C (PKC) phosphoryliert, im Gegensatz zu Ser-282, das bei nicht physiologischen Calciumkonzentrationen hauptsächlich durch PKA und CAMKII phosphoryliert wird. Bei DCM-Patienten besteht die Möglichkeit einer Kompensation der PKA- und/oder PKC-Dynamik, die sich auf die Phosphorylierung von Ser 273 auswirken könnte. Daher könnte dies bei DCM-Patienten und nicht bei HCM-Patienten nur minimale Auswirkungen haben. Sowohl ser-282 als auch ser-302 sind an der Beschleunigung der Kinetik von cMyBP-C beteiligt und werden durch CAMKII phosphoryliert. Es wurde gezeigt, dass die Ablation der ser282-Phosphorylierung die ser-302-Phosphorylierung durch CAMKII verringert. Obwohl p302 aufgrund begrenzter Patientenproben nicht untersucht wurde, deuten unsere Daten darauf hin, dass bei HCM- und DCM-Patienten unterschiedliche Phosphorylierungsstellen betroffen sein könnten.

Eine verringerte Phosphorylierung von cMyBP-C wurde mit einer beeinträchtigten Kontraktilität bei Patienten mit Herzinsuffizienz in Verbindung gebracht27. Hier haben wir die zuvor veröffentlichten cMyBP-C-Peptide 302A und 302S21, Surrogate der regulatorischen Phosphorylierungsstelle Serin 302, als Hilfsmittel verwendet, um zu bestimmen, ob die Modulation des Dephosphorylierungszustands von cMyBP-C die Herzkontraktion und -entspannung bei experimenteller Herzinsuffizienz (HF) verbessern kann. Modelle. Um die Auswirkungen von Peptiden auf die Modulation von cMyBP-C vollständig zu charakterisieren, haben wir die Peptide daher in drei verschiedenen rekombinanten In-vitro- und Ex-vivo-Assays bewertet: einem Steady-State-ATPase-Assay, einem Myofibrillen-ATPase-Assay und einem Papillarmuskel-Assay. Im Steady-State-ATPase-Assay wurde in keiner der Behandlungsgruppen eine Veränderung der ATPase-Aktivität beobachtet (Abb. 3). Wenn jedoch Myofibrillenproteine aus erkrankten Modellen, d. h. dem Ratten-MI-Modell oder dem Maus-cMyBP-CAAA-Modell, isoliert wurden, wurde eine konsistente Verbesserung der ATPase-Aktivität in den mit 302S- und 302A-Peptiden behandelten Gruppen beobachtet (Abb. 4, 5). Diese Verbesserung der ATPase-Aktivität stand im Einklang mit der Verbesserung der Kontraktilität unter Verwendung von Papillarmuskelfasern, die aus transgenen cMyBP-CAAA-Mäusen isoliert wurden (Abb. 6). Zusammengenommen zeigten diese Daten die Notwendigkeit, cMyBP-C-zielgerichtete Therapien unter pathologischen Bedingungen zu evaluieren. Darüber hinaus deuten die obigen Ergebnisse stark darauf hin, dass ein intaktes Sarkomer für die Aktivität von Peptiden erforderlich ist, um die Kinetik von cMyBP-C und seine Rolle bei der Modulation der Herzfunktion ordnungsgemäß zu erfassen. Aufgrund der begrenzten Permeabilität der Peptide war eine Immunlokalisierung der Peptide auf intakten Herzmuskelzellen oder Sarkomeren nicht möglich.

Da wir die verbesserten kardialen Wirkungen von Peptiden bei HF-Modellen beobachteten, die eine verringerte cMyBP-C-Expression oder Phosphorylierung gezeigt hatten, stellten wir die Hypothese auf, dass die Peptide wahrscheinlich die Wechselwirkung von cMyBP-C und Myosin unterbrachen und so die Wechselwirkung des Myosinkopfes mit dem dünnen Filament verbesserten und daher Krafthub. Unter physiologischen Bedingungen (NTG/DDD oder normal) erleichtert phosphoryliertes cMyBP-C die Aktivierung des Cross-Bridge-Zyklus und bindet die dicken und dünnen sarkomeren Filamente (Abb. 7; linkes Feld). Wenn cMyBP-C jedoch in erkrankten Zuständen (AAA oder HF) dephosphoryliert, interagiert es stark mit Myosin und verhindert so dessen krafterzeugende Wechselwirkung mit Aktin (Abb. 7; mittleres Feld). Die von uns getesteten cMyBP-C-Peptide könnten die enge Wechselwirkung zwischen cMyBP-C und Myosin unterbrechen und die dicken Filamente freisetzen, um ihre Wechselwirkung mit den dünnen Filamenten wieder aufzunehmen und so die Muskelkontraktilität zu verbessern (Abb. 7; rechtes Feld).

Diagramm, das die Wirkung des cMyBP-C-Phosphorylierungszustands auf die Actomyosin-Wechselwirkung im Vergleich zur Wirkung der cMyBP-C-Peptide 302A und 302S im Kontext der Kreuzbrückenbildung zeigt. Ohne Phosphorylierung (oben) würde die Position der Aktin-Bindungsstelle von cMyBP-C etwa 3 nm vom dünnen Filament entfernt liegen. Die Phosphorylierung von cMyBP-C (Mitte) würde die Querbrücke bis zur Oberfläche des dünnen Filaments verlängern und dadurch die Packung des Stäbchenteils des Myosinmoleküls lockern. Das permeabilisierende 302A-Peptid hemmt die Interaktion von Myosin mit cMyBP-C (unten), was zu seiner Bewegung in Richtung Aktin führt, was wiederum zur Bildung von Aktomyosin-Wechselwirkungen und Querbrücken führt und so die Kontraktilität erhöht.

Über die Relevanz der cMyBP-C-Phosphorylierung wurde in mehreren transgenen Nagetiermodellen berichtet, indem Serin an den Phosphorylierungsstellen ersetzt wurde, um aktiviertes cMyBP-C nachzuahmen, wie beispielsweise im transgenen DDD-Mausmodell18,19. Eine Verringerung der Phosphorylierungsstellen in cMyBP-C kann zu einer Verringerung der Proteinexpression beitragen. Hier beobachteten wir, dass eine solche verringerte Phosphorylierung mit einer verringerten Gesamtexpression von cMyBP-C korrelierte (Abb. 1). Kürzlich wurde in Studien über die Abgabe von MYBPC3-cDNA zur Verbesserung der Herzfunktion berichtet. Es wurde berichtet, dass eine einzelne systemische Dosis von AAV9-tragender MYBPC3-cDNA die MYBPC3-mRNA- und -Proteinspiegel wiederherstellen und die Entwicklung einer linksventrikulären Hypertrophie (LVH) bei MYBPC3-gezielten Knock-in-Mäusen mit nur 20 % cMyBP-C verhindern konnte Protein28. Eine andere Studie berichtete, dass AAV6-tragende MYBPC3-cDNA eine ähnliche Verbesserung in künstlich hergestelltem 3D-Herzgewebe erzielen konnte29,30. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass AAV9-tragende MYBPC3-cDNA die Entwicklung einer Hypertrophie in menschlichen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten von HCM-Patienten unterdrückt31. Allerdings könnte die dauerhafte Verwendung von AAV9 als Therapie Nachteile mit sich bringen, da es an Wissen über die Zell- und Ganzkörperdisposition, die Dosis-Expositions-Beziehung und die Expositions-Wirkungs-Beziehung sowie über die Auswirkung der Immunogenität auf diese wichtigen Eigenschaften mangelt32. Daher ist die Suche nach spezifischen Molekülen, die auf cMyBP-C und seine Protein-Protein-Wechselwirkung abzielen, von entscheidender Bedeutung, um eine wirksame Therapie vom Labor ans Krankenbett zu bringen. Unsere Studie war durch die schlechte Permeabilität und Stabilität der cMyBP-C-Peptide eingeschränkt, was unsere Tests auf In-vitro- und Ex-vivo-Umgebungen beschränkte, in denen wir Myofibrillenproteine und permeabilisierte Papillarmuskelfasern verwendeten. Daher würden weitere Studien in einer In-vivo-Umgebung mit permeablen Peptiden und guter Stabilität ein umfassenderes Verständnis der Mechanismen der cMyBP-C-Modulation in der Herzfunktion ermöglichen.

Das Rattenmodell mit Myokardinfarkt (MI) wurde bereits charakterisiert33. 28 männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), im Alter von 8 bis 10 Wochen und mit einem Gewicht von 180–250 g, wurden verwendet, um einen MI durch die linke vordere absteigende Koronararterie (LAD) auszulösen. Ligation. Wir haben uns während der gesamten Studie für den Umgang mit Tieren an die ARRIVE-Richtlinien gehalten. Alle Verfahren wurden von der Institutionellen Ethikkommission für die Verwendung und Pflege von Labortieren bei Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA, genehmigt. Kurz gesagt, die Tiere wurden unter Narkose einer linksseitigen Thorakotomie unterzogen. Der Herzbeutel wurde aufgeschnitten und LAD identifiziert. Ein Koronararterienverschluss wurde locker etwa 2 mm unterhalb des Ursprungs um die LAD gelegt und dann wurde der Verschluss gezogen, um die Koronararterie zu unterbinden. Der Infarkt wurde durch Bleichen und Verfärben des linken Ventrikels und ST-Hebung im EKG definiert. Dann wurde die Truhe verschlossen. Die Tiere wurden nach der Operation engmaschig auf chirurgische Komplikationen überwacht. Dreiundzwanzig männliche SD-Ratten mit ähnlichem Alter und Körpergewicht wurden als Scheintiere zugeordnet, die eine ähnliche Thorakotomie erhielten, um Zugang zum Herzen und einen Wundverschluss zu erhalten, jedoch ohne LAD-Ligatur. Die Post-MI-Bewertung zur Bestätigung von Infarkten wurde durch Echokardiographie an Tag 3, Woche 1, Woche 4 und Woche 8 durchgeführt. In der Zwischenzeit wurden die folgenden globalen Herzfunktionsparameter gemessen: LV-endsystolischer und diastolischer Innendurchmesser (mm), LV-endsystolischer und diastolisches Volumen (µL), Schlagvolumen (µL), Herzzeitvolumen (ml/min) und Herzfrequenz (BPM) (Ergänzende Abb. S1). Tiere mit einem kleinen Infarkt und einer Ejektionsfraktion (EF) > 40 % wurden von der Studie ausgeschlossen. Die vier Beendigungszeitpunkte waren Tag 3, Woche 1, Woche 4 und Woche 8. Zu jedem Beendigungszeitpunkt wurden die Ratten anästhesiert und die Herzen herausgeschnitten, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert .

Zuvor beschriebene herzspezifische transgene phosphoablatierte (AAA) und phosphomimetische (DDD) Mausmodelle von cMyBP-C mit Promotor der schweren Kette von α-Myosin wurden verwendet, um mehrere Linien von FVB/N-Mäusen zu erzeugen18,19,34,35. Kurz gesagt, die bekannten wichtigen Phosphorylierungsstellen (Ser-273, Ser-282 und Ser-302) auf cMyBP-C und zwei benachbarte potenziell alternative Phosphorylierungsstellen (Thr-272 und -281) wurden in Alanin (A) und Asparaginsäure umgewandelt (D) Rückstände unter Verwendung von Standard-PCR-basierten Methoden. Alle Experimente wurden nach institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der University of Cincinnati genehmigt. In dieser Studie wurden erwachsene Mäuse gemischten Geschlechts im Alter von 12–14 Wochen verwendet.

Die cMyBP-C-Inhibitorpeptide wurden in den Forschungslabors von Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA, synthetisiert. Alle Peptide wurden durch hochauflösende Massenspektrometrie dahingehend charakterisiert, dass sie bestätigte Reinheitswerte nahe oder über 90 % und genaue Massenwerte aufwiesen, die den aufgrund der Sequenzen erwarteten Werten entsprachen. Die Sequenzen der vier in dieser Studie verwendeten Originalpeptide sind in Tabelle 121 aufgeführt. Reinheit und genaue Massenanalyse wurden gleichzeitig durch Umkehrphasen-LC-UV/MS unter Verwendung eines Waters ACQUITY I-Klasse-Flüssigkeitschromatographen (Waters, Milford, MA) durchgeführt mit einem Xevo G2-XS QTOF-Massenspektrometer, das im ESI + Ionisationsmodus arbeitet. Es wurde eine stationäre Phase vom Typ Waters BEH C18, 1,7 μm, 130 Å, 2,1 × 150 mm (Teilenummer 186003556) mit 0,1 % Trifluoressigsäure in destilliertem Wasser (dH2O) (A) und 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril (B) als mobile Phasen verwendet . Die Säule wurde isotherm bei 55 °C gehalten, mit einem linearen Gradienten von 5 bis 55 % B über 25 Minuten, wobei eine Flussrate von 0,4 ml/min verwendet wurde.

Der Phosphorylierungsgrad der cMyBP-C-M-Domäne an drei Serinresten (p273, p282, p302) wurde bei SD-Ratten, die einer MI-Operation unterzogen wurden, unter Verwendung des Western Immunoassay (Wes)-Verfahrens (ProteinSimple, Santa Clara, CA) bestimmt. Infarktgewebe des linken Ventrikels wurde in einem RIPA-Puffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren, lysiert. Die Proteinschätzung wurde gemäß dem Kit durchgeführt (Pierce™ BCA Protein Assay Kit 23225, Thermo Fisher Scientific). Die Proben wurden gemäß dem Wes-Protokoll gemäß den ProteinSimple-Empfehlungen vorbereitet. Die für die Expressionsstudie verwendeten Antikörper sind wie folgt: Anti-cMyBP-C p273 (1:250), cMyBP-C p-282 (1:250), cMyBP-C p302 (1:250) (alle im Rahmen einer Materialtransfervereinbarung bereitgestellt). von Professor Sakthivel Sadayappan, College of Medicine, University of Cincinnati); cMyBP-C insgesamt (Santa Cruz Cat # SC-137182, Lot # E2913 [1:5 für Wes]); Myosin-Schwerkette (Abcam ab207926 (3-48G5C7); Alpha-(Herz-)Aktin (Sigma-Aldrich A9357-Klon AC1-20.4.2); Troponin I (Cell Signaling 13083S [D6F8]); und Troponin T (Sigma-Aldrich T6277-Klon). JLT-12). Die Daten wurden auf die Expression der Housekeeping-Proteine α-Actin oder Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) normalisiert, um der geladenen Proteinmenge zu entsprechen.

IHC-Studien wurden mit Herz-Seriengewebeschnitten von erwachsenen menschlichen Patienten (normale Probanden, HCM-Patienten und DCM-Patienten) durchgeführt. Alle Methoden wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften von Nanjing KeyGen BioTech Co., Ltd. und Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. durchgeführt. Alle Versuchsprotokolle wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und vom Affiliated Drum Tower Hospital, Medical genehmigt Schule der Universität Nanjing. Die Einverständniserklärung aller Probanden und/oder ihres Erziehungsberechtigten wurde vom angeschlossenen Drum Tower Hospital der Medizinischen Fakultät der Universität Nanjing eingeholt. Kurz gesagt, Gewebeschnitte wurden in Xylol entparaffiniert und durch abgestufte Alkoholwäschen rehydratisiert, bevor sie mit einem Peroxidaseblock (3 % H2O2-Methanol) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden, um die endogene Peroxidaseaktivität zu hemmen. Nach dem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden die Schnitte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA, 50–100 μl) blockiert, um eine unspezifische Bindung des Nachweisreagenzes zu verhindern. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit dem Primärantikörper (50–100 μl; maßgeschneiderte polyklonale Kaninchenantikörper [GenScript, Piscataway, NJ]) inkubiert: p-273 (AFRRTpSLAGAGC), p282 (GAGRRTpSDSHEDAC) und Gesamtprotein (AFRRTSLAGAGC). ) in einer feuchten Kammer bei 4 °C über Nacht. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einem Verstärker (50–100 μl) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit PBS gewaschen. Die Schnitte wurden dann mit ImmPRESS HRP PLUS Polymer (Maus/Kaninchen, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit PBS gewaschen. Anschließend wurde bei Raumtemperatur etwa 3–5 Minuten lang eine Mischung aus 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Chromogen und Substrat zugegeben, um eine ordnungsgemäße Farbentwicklung zu ermöglichen. Anschließend wurde die Reaktion durch Waschen der Schnitte mit Wasser beendet. Anschließend wurden die Schnitte 15 Minuten lang mit Hämatoxylin gegengefärbt und mit Wasser gespült. Abschließend wurden die Schnitte in einer aufsteigend abgestuften Alkoholspülung dehydriert, die mit einer Xylolwäsche endete. Zum Abdecken der Abschnitte wurde neutraler Balsam verwendet. Die gefärbten Objektträger wurden mit einem Mikroskop bei 200-facher oder 400-facher Vergrößerung abgebildet, um die Proteinexpression zu bewerten. Die positive Expression von Phosphoproteinen wurde durch das Verhältnis der positiven Region zur Gesamtfläche bestimmt und unter Verwendung der Werte der Gesamtproteinexpression normalisiert.

Ein Steady-State-ATPase-Assay wurde durchgeführt, indem die Freisetzung von anorganischem Phosphat mithilfe der kolorimetrischen Methode gemessen wurde. Die ATPase-Reaktion wurde in einem Reaktionspuffer bestehend aus 15 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2 und 0,1 mM EGTA durchgeführt. Myosin und FL cMyBP-C- und C0-C2-Domäne wurden in den Forschungslabors von Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA, mit Modifikationen gemäß Referenzen36,37 hergestellt. Aktin wurde mit geringfügigen Modifikationen in denselben Forschungslabors aus Kaninchenskelettmuskel hergestellt38,39. Alle im Assay verwendeten Proteine wurden in einem Reaktionspuffer verdünnt. Eine 30-µL-Reaktion wurde durch Zugabe von FL oder verkürztem cMyBP-C (C0-C2), Myosin (1 µM), F-Actin (10 µM) und ATP (2 mM) aufgebaut. F-Actin wurde aus G-Actin durch Zugabe von 50 mM KCl und 2 mM MgCl2 hergestellt, gefolgt von kurzem Vortexen und 30-minütiger Inkubation auf Eis zur Polymerisation. Die Platte wurde 15 Sekunden lang bei 2000 U/min gedreht, um die Blasenbildung zu reduzieren, und die Reaktionsplatte wurde 60 Minuten lang bei 37 °C unter ständigem Schütteln inkubiert. Die Reaktion wurde durch Verdünnen der Proteine (1:20) in Wasser gestoppt. 30 µL der 1:20-Reaktionsmischung wurden auf eine frische Platte übertragen und Wasser zugegeben, um gemäß den Anweisungen des Kits (Abcam ab65622, Waltham, MA) auf 200 µL aufzufüllen. Phosphatstandards wurden ebenfalls gemäß den Kit-Anweisungen hergestellt. Schließlich wurden 30 µL Nachweisreagenz in alle Standard- und Probenvertiefungen gegeben, 30 Minuten bei RT unter ständigem Schütteln inkubiert und dann am 650-nm-Endpunkt in SpectraMax (Molecular Devices, San Jose, CA) abgelesen.

Die myofibrilläre ATPase-Aktivität wurde durch Messung der Freisetzung von anorganischem Phosphat bestimmt40. Myofibrilläre Proteine wurden isoliert und gereinigt, wie bereits berichtet41,42, und in einem F60-Puffer mit 500 mM NaCl suspendiert. Diese Proteine wurden aus Herzproben von Ratten in der ersten Woche nach MI und Scheinherzen sowie aus Herzproben von transgenen cMyBP-C-Mäusen (NTG, AAA und DDD) extrahiert. Das Protein wurde dann durch Coomassie-Blau-Färbung (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) von SDS-PAGE-Gelen bestimmt (ergänzende Abbildung S10). Die Reaktionsmischung enthielt 0,25–0,5 mg/ml myofibrilläre Proteine, 15 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA und 5 mM ATP (pH 7,0). Die Tests wurden in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen bei pCa2+-Konzentrationen (pCa) von 8,0 bis 2,0 bei 37 °C durchgeführt. Die 120-µl-Reaktionsmischung wurde 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und 3 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Jeweils 30 µL Überstand wurden in eine neue Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen überführt und mit 170 µL destilliertem Wasser (dH2O) gemischt. Ein 30 µL Nachweisreagenz (Phosphate Assay Kit, Abcam) wurde hinzugefügt, um eine Reaktion zur Farbentwicklung auszulösen. Anschließend wurde die Produktion von anorganischem Phosphat kalorimetrisch bei 625 nm unter Verwendung eines kinetischen Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices) bestimmt. Die durch Kalzium stimulierte ATPase-Aktivität wurde berechnet, indem die Aktivität bei pCa 2,0 von der Aktivität bei pCa 8,0 abgezogen wurde.

Ganze Herzen wurden schnell herausgeschnitten und mit 1× Krebs-Henseleit-Puffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 1 g D-Glucose, 0,84 g NaHCO3 und 0,76 g BDM. Jedes Herz wurde geschnitten, um die Papillarmuskeln im linken Ventrikel sorgfältig freizulegen. Wie zuvor beschrieben34, wurden die Papillarmuskeln unter einem Präparierrohr (V8 Stereo, PlanAPO S 0,63× FWD 81 mm, Zeiss, Dublin, CA) herausgeschnitten und über Nacht in 1 % Triton X-100, vorverdünnt auf 10 % in entspannender Montagelösung, permeabilisiert ( 97,92 mM KOH, 6,24 mM ATP, 10 mM EGTA, 10 mM Na2CrP, 47,58 mM Kaliumpropionat, 100 mM BES, 6,54 mM MgCl2 und 1 mM DTT) bei 4 °C, um die Zellmembran und membrangebundene Proteine zu entfernen. Die Papillarmuskeln wurden dann unter dem Präpariermikroskop weiter in etwa 1 mm lange Faserbündel geschnitten. Gerade Faserbündel wurden aufgrund ihrer Gleichmäßigkeit ausgewählt und dann an jedem Ende mit Aluminium-T-Clips befestigt. Jedes Faserbündel wurde vorsichtig mit einer frischen Entspannungslösung auf Eis gewaschen und innerhalb von 12 Stunden verwendet. Die T-Clip-Fasern wurden dann an einem Kraftaufnehmer und einem Hochgeschwindigkeits-Längenregler (Aurora Scientific, Inc., Aurora, ON, Kanada) befestigt. Die Muskelabmessungen (Querschnittsfläche, Länge) wurden mit einem am Dissektionsmikroskop montierten Augenmikrometer bestimmt (Auflösung ~ 10 μM). Diese Muskeldimensionen wurden verwendet, um die Kontraktionskraft und die Sarkomerlänge zu normalisieren. Letzterer wurde auf 2,0 μM eingestellt und kontinuierlich durch das High-Speed Video Sarcomere Length (HVSL)-Messsystem von Aurora überwacht. Die Stärke und der Abbau der Muskelfaserbefestigung wurde bestimmt, indem die befestigten Fasern zu Beginn und am Ende des Versuchsprotokolls der maximal mit Kalzium gesättigten Aktivierungslösung ausgesetzt wurden. Die sich entwickelnde isometrische Kraft wurde bei unterschiedlichen Calciumkonzentrationen (pCa von 10,0 bis 4,5) in Gegenwart oder Abwesenheit von Peptiden aufgezeichnet, und bei jedem Aktivierungszyklus wurde von allen Kraftaufzeichnungen ein Null-Basiskraftniveau abgezogen. Alle Kraftmessungen wurden um den Rundown korrigiert und auf die Querschnittsfläche normiert. Fasern mit einem Rundown von mehr als 20 % wurden von der Datenanalyse ausgeschlossen. Die Daten wurden mit dem Echtzeit-Muskeldatenerfassungs- und -analysesystem 600A von Aurora erfasst. Jede einzelne Kraft-Kalzium-Beziehung wurde an eine modifizierte Hill-Gleichung angepasst (Kraft/Kraftmax = [Ca2+]n/(pCa50n + [Ca2+]n), in der n die Hill-Steigung ist. Ebenso betrug die Rate der Spannungsneuentwicklung (ktr). wird auch in Fasern gemessen, die aus AAA-, DDD- und NTG-Herzgewebe bei pCa 4,5 gewonnen wurden.

Sofern nicht anders angegeben, werden alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism (Version 6.0, GraphPad Software, San Diego, CA) durchgeführt. Die Daten wurden mithilfe einer zweifaktoriellen ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test analysiert. Ein p < 0,05-Wert wurde als statistisch signifikant angesehen.

Nichtphosphorylierte Alanine

Dilatative Kardiomyopathie

Phospho-mimetische Asparaginsäuren

Destilliertes Wasser

Enddiastolisches Volumen

Ejektionsfraktion

Endsystolisches Volumen

Gewalt

Fluoresceinisothiocyanat

In voller Länge

Hypertrophe Kardiomyopathie

Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase-Gen

Vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen

Sanierungsrate erzwingen

Enddiastole mit Innendurchmesser des linken Ventrikels

Endsystole mit Innendurchmesser des linken Ventrikels

Schwere Kette von Myosin

Herzinfarkt

Leichte Myosinkette

Nicht transgen

α-Tropomyosin

Troponin T

Troponin I

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Wir danken Iffet Armstrong, Designerin für Forschungspräsentationen, wissenschaftliche und medizinische Ausbildung bei Merck Creative Studios, für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Illustration für Abb. 7.

Mohit Kumar wurde durch ein Predoctoral Fellowship der American Heart Association (17PRE33630192) unterstützt. Sakthivel Sadayappan hat Unterstützung von den National Institutes of Health erhalten: Zuschüsse R01 AR078001, R01 HL130356, R38 HL155775 und R01 HL143490; American Heart Association 2019 Institutional Undergraduate Student (19UFEL34380251) und Transformation (19TPA34830084) Auszeichnungen; und Unterstützung von Novo Nordisk, Amgen, AstraZeneca, MyoKardia und Merck.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Luqia Hou und Mohit Kumar.

Kardiometabolische Abteilung, Merck & Co., Inc., 213 East Grand Ave., South San Francisco, CA, 94080, USA

Luqia Hou, Priti Anand, Yinhong Chen, Nesrine El-Bizri und Gayathri Swaminath

Analytische Forschung und Entwicklung, Merck & Co., Inc., South San Francisco, CA, 94080, USA

Chad J. Pickens

Discovery Chemistry, Merck & Co., Inc., South San Francisco, CA, 94080, USA

W. Michael Seganish

Abteilung für kardiovaskuläre Gesundheit und Erkrankungen, Abteilung für Innere Medizin, Herz-, Lungen- und Gefäßinstitut, Universität Cincinnati, Cincinnati, OH, 45267, USA

Mohit Kumar und Sakthivel Sadayappan

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LH und MK haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen. LH, MK, SS und GS konzipierten und gestalteten die Experimente. LH, MK, PA, YC, NE und CP führten die Experimente durch und analysierten experimentelle Daten. WMS half bei der Synthese der Peptide. LH und MK haben das Manuskript verfasst. GS und SS halfen beim Schreiben, Bearbeiten und Überprüfen des Manuskripts. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen.

Korrespondenz mit Gayathri Swaminath.

Sakthivel Sadayappan hat der Leducq Foundation, Pfizer, Novo Nordisk, Amgen, AstraZeneca und MyoKardia Beratungs- und Verbundforschungsstudien zur Verfügung gestellt, diese Arbeit steht jedoch in keinem Zusammenhang mit dem Inhalt dieses Manuskripts. Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt mit dem Inhalt dieses Artikels haben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hou, L., Kumar, M., Anand, P. et al. Die Modulation von Myosin durch kardiale Myosin-bindende Protein-C-Peptide verbessert die Herzkontraktilität in experimentellen Ex-vivo-Herzinsuffizienzmodellen. Sci Rep 12, 4337 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-08169-1

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Eingegangen: 05. Oktober 2021

Angenommen: 03. März 2022

Veröffentlicht: 14. März 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-08169-1

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